REPLIKASI DAN EKSPRESI GEN

1. PROSES REPLIKASI PADA PROKARIOT DAN EUKARIOT

Replikasi merupakan proses pengkopian atau duplikasi DNA. Mesin yang mengkopi DNA memiliki sejumlah protein dan mengikuti aturan-aturan yang ditetapkan untuk setiap organisme. Replikasi DNA dimulai pada titik khusus yang disebut Origins of Replication dan berjalan secara dua arah dan serempak. Proses replikasi DNA secara semikonservatif karena setiap hasil copi DNA ganda yang baru berisi satu untai (template) yang lama (induk) dan satu untai komplementer yang baru. DNA Polimerase merupakan enzim yang mengkatalisis ikatan kovalen antara fosfat dari satu nukleotida dan deoksiribosa (gula) dari nukleotida berikutnya, DNA polimerase hanya bisa mensintesis untai baru dari  arah 5 'ke 3' sehingga arah bacanya dari arah 3' ke 5'.

Terdapat tiga tahap dalam replikasi DNA yaitu: inisiasi, elongasi dan terminasi.

1.    Inisiasi

Terdapat Primase yang menggabungkan nukleotida RNA menjadi primer. Sebab DNA polimerase tidak dapat  memulai sintesis untai baru, jadi harus membentuk primer. Kemudian DNA polimerase menambahkan nukleotida DNA pada primer , DNA polimerase menempel ke ujung 3 'pada RNA primer, DNA lain mengganti RNA dengan DNA sehingga untai anak lengkap.

2.      Elongasi

Pemanjangan DNA baru dikatakan dengan replikasi garpu. Menggunakan enzim yaitu DNA polimerase. DNA polimerase menggunakan setiap helai sebagai template pada arah 3' ke 5'. Jadi DNA baru dapat memanjang hanya pada arah 5' ke 3'. DNA polimerase menambahkan nukleotida hanya pada ujung untai tumbuh 3'. DNA polymerase III dapat mensintesis untai komplementer terus menerus dengan memanjangkan DNA yang baru dengan arah 5' ke 3'  dan bergerak menuju garpu replikasi kemudian menghasilkan leading strand dan lagging strand atau dapat dikatakan semi-discontinous yaitu leading strands yang bersambung terus-menerus rantainya dan lagging strands terputus-putus.

Lagging strand disintesis sebagai rangkaian segmen yang terputus-putus yang disebut fragmen Okazaki, fragmen Okazaki kemudian akan bergabung dengan DNA ligase membentuk satu untai DNA tunggal.

Sintesis leading strands dan lagging strands selama proses replikasi DNA.

1.      Pemanjangan yang dilakukan DNA polimerase III hanya pada arah 5' ke 3'.

2.      Salah satu untai baru, lagging strands, dapat memanjang terus 5' ke 3' ketika replikasi garpu berlangsung.

3.      Untai baru lainnya, lagging strands harus tumbuh dalam keseluruhan dari arah 3' ke 5'

dengan penambahan segmen pendek, fragmen Okazaki, yang tumbuh dari atah 5' ke 3'.

4.      DNA ligase bergabung dengan fragmen Okazaki membentuk ikatan bebas antara ujung mereka menghasilkan untai yang bersambung atau continous.

Pada leading strands hanya satu primer yang diperlukan untuk sintesis sedangkan sintesis  pada lagging strands , setiap fragmen Okazaki primer harus secara terpisah.

Enzim yang berperan dalam proses Replikasi DNA yaitu:

1.      Helikase, membuka pilinan DNA heliks ganda, dimulai dari “origin of replication”.

2.      SSBP, menstabilkan rantai-rantai yang telah dibuka.

3.      Topoisomerases  mengurangi puntiran rantai.

4.      Primase, membuat RNA primer yang akan melekat pada rantai template (rantai induk).

5.      DNA polymerase memperpanjang rantai baru dengan menambahkan nukleotida hanya dari ujung 3'.

6.      DNA polimerase I, membuang nukleotida pada RNA primer dan menggantinya dengan nukleotida DNA.

7.      DNA ligase, menggabungkan ujung 3′ dari DNA yang menggantikan primer ke bagian lain dari leading strand dan menggabungkan fragmen-fragmen Okazaki pada laging strand.

 A.    Proses replikasi DNA secara keseluruhan

1. DNA Helicase membuka dan memisahkan kedua rantai DNA, dimulai dari origin of replication.

                 2. Single Stranded Binding Proteins  (SSBP) menstabilkan rantai-rantai tunggal dari hasil                    pemisahan pilinan induk.

1.  

3. Topoisomerase mengurangi puntiran rantai dengan mengatur tingkat pilinan yang disebabkan oleh pemisahan rantai.

4. DNA polymerase hanya dapat menambahkan nukleotida di ujung 3’ rantai yang ada sebelumnya.

5. DNA Primase membuat RNA primer yang sesuai dengan rantai template yang akan melekat di rantai template yang akan menghadirkan rantai dengan ujung bebas 3’ agar DNA polymerase berfungsi.

6. RNA primer dibuat dengan cara melekatkan ribonucleotida ke ujung bebas 5’ ribonucleotida sebelumnya.

7. DNA polymerase mensintesis rantai baru dengan menambah deoxyribonucleotida ke ujung 3’OH deoxyribonucleotida sebelumnya.

8. Penambahan deoxyribonucleotida baru menyebabkan pelepasan molekul  sebuah PPi yang kemudian dihidrolisis menjadi dua molekul Pi.

9. Rantai baru selalu disintesis dengan arah orientasi 5’ ke 3’ dan rantai lama dikopi dengan arah 3’ ke  5’.

10. Leading strand direplikasi searah dengan garpu replikasi dan berlangsung terus menerus.

11. Okazaki fragments merupakan rantai yang terputus-putus dan mengandung RNA

12. Untuk menghasilkan rantai DNA yang utuh maka RNA dilepaskan (RNAse H) dan diganti dengan DNA (DNA polymerase) dan rantai-rantai terputus itu disambung dengan DNA Ligase.

Proses replikasi prokariot dan eukariot serupa. Perbedaan proses replikasi pada prokariot dan eukariot yang paling utama adalah berkaitan dengan jumlah DNA. Eukariot memiliki jumlah DNA jauh lebih banyak dari prokariot (lebih 1000 kali dari jumlah E. Coli) dan memiliki protein histon dalam nukleosom. Replikasi pada prokariot terdapat satu titik mulai (origin of replication) sedangkan replikasi pada eukariot mempunyai banyak titik (origin of replication) tempat awal replikasi dimulai. DNA polimerase pada eukariot yaitu a, b, d, g dan e. Sedangkan DNA polimerase pada prokariot yaitu polimerase I, II, dan III. DNA polimerase pada prokariotik dan eukariot memiliki fungsi yang berbeda. Pada eukariot fragmen Okazaki lebih pendek daripada prokariot.

2. PROSES TRANSKRIPSI  (PROKARIOT DAN EUKARIOT)

Transkripsi merupakan proses mensintesis protein gen (serangkaian DNA) dikopi menjadi RNA. Enzim yang digunakan adalah RNA polimerase yang membuka pilinan kedua untai DNA sehingga terpisah. RNA dapat menambhakan nukleotida hanya pada ujung 3' dari polimer yang sedang tumbuh. Molekul RNA memanjang dari arah 5' ke 3'.

Ada tiga tahapan dalam transkripsi:

1.    Inisiasi – pada tahap ini transcription machinery melekat pada DNA yang akan dikopi menjadi RNA.

2.    Elongasi – setelah transcription machinery melekat dengan baik, maka proses transkripsi dimulai dan sebuah rantai RNA baru disintesis.

3.     Terminasi – setelah gen selesai dikopi, transkripsi dihentikan dan transcription machinery dan rantai baru RNA melepaskan diri DNA.

A. Proses Transkripsi Eukariot

1.  Inisiasi

-          Pada tahap ini, RNA polymerase melekat erat ke DNA pada poin/urutan basa yang sangat spesifik yang terletak pada at very specific points, Urutan basa ini disebut promotor.

-          Pada eukariotik, RNA polymerase membutuhkan protein lain yang disebut transcription  factors (TF)  untuk memulai transkripsi. Hal ini disebabkan inisiasi transkripsi pada eukaryotik harus menghadapi masalah pemaketan DNA yang rumit.

-          Organisme Eukariotik membutuhkan beberapa protein yang membantu proses inisiasi:

a.       Activators – Protein yang melekat ke tempat khusus DNA untuk menarik RNA Polymerase. Hal ini penting bagi RNA polymerase untuk mengatasi masalah pemaketan DNA.

b.      Mediators – Protein yang mengizinkan komunikasi antara activators dan  RNA polymerase dan antara protein lainnya (other general transcription factors)

c.       Chromatin modifying proteins – Protein yang memodifikasi paket DNA agar RNA polymerase melekat pada DNA.

-          Begitu polimerase terikat kuat dengan DNA promotor, kedua untai DNA mengulur dan enzim mulai mentranskripsi untai cetakannya.

2. Tahap Elongasi

-          Setelah tahap inisiasi dilakukan, RNA polymerase akan bergerak di sepanjang rantai DNA dan membuka pilinan heliks ganda untuk mengkopinya menjadi RNA.

-          Polimerase menambahkan nukleotida ke ujung  3’ dari molekul RNA yang sedang tumbuh di sepanjang heliks ganda.

-          Pergerakan RNA polymerase di sepanjang rantai DNA dapat menyebabkan supercoiling. Hal ini akan diringankan oleh DNA Topoisomerases

-          Pada eukaryotes, transcription factors ditukar dengan  elongation factors

-          mRNA pada organisme eukaryotic dimodifikasi saat tahap elongation berlangsung yaitu dengan menambahkan molekul 7-methylguanosine (tutup 5’ atau 5’ cap) ke ujung 5’, untuk menandai mereka sebagai mRNA.

-          Ujung itu ditambah segera setelah proses DNA dikopi pada 25 Nukleotida pertama. Ujung itu juga memfasilitasi proses lebih lanjut, export dan translasi mRNA.

-          mRNA pada eukaryotik mengandung bagian intron dan ekson, bagian intron harus dibuang karena tidak ikut menentukan urutan asam amino pada protein.

-          Saat RNA polymerase membuat mRNA, intron dibuang melalui sebuah proses yang disebut RNA splicing

-          RNA splicing dilakukan oleh RNA-Protein structure yang disebut Spliceosome

-          Sinyal khusus dari mRNA menunjukkan dimana keberadaan intron dan exon.  Sinyal-sinyal itu yaitu letak sambungan 5’ dan 3’  dan titik percabangan. RNA splicing akan membuat intron menjadi loop (simpulan) dan memotongnya dari ujung exon.

-          mRNA yang tidak mengandung intron membentuk cap di ujung 5' dan dilengkapi dengan sebuah ekor poli(A) membentuk kompleks dengan protein dn bergerak menembus pori-pori di selubung inti menuju sitolasma. Di sitoplasma mRNA tersebut bergabung dengan ribosom dan mengarahkan penggabungan asam amino kedalam protein.

3. Tahap Terminasi

-          Pada eukaryotik pada tahap termination mRNA akan dimodifikasi.

-          mRNA disebut pre-mRNA sebelum semua modifikasi selesai dilakukan.

-          Ujung 3’ mRNA dibuat menjadi lebih spesifik sehingga dapat dikenali oleh sejumlah protein RNA binding dan yang memodifikasi RNA yang akan berikatan RNA polymerase II.

-          CstF (Cleavage stimulation factor F) and CPSF (Cleavage and polyadenylation specificity factor), berikatan dengan RNA polymerase II, memotong RNA pada ujung 3’ dan bantuan enzim lain yaitu poly-A polymerase, menambah nukleotida adenosine (A)  untuk membuat ekor –A (poly-A-tail).

Dapat diringkas bahwa RNA eukariotik mengalami transkripsi di inti oleh tiga RNA polimerase yang berbeda. Transkrip primer mengalami modifikasi dan pemangkasan untuk menghasilkan RNA matang yang kemudian berpindah ke sitoplasma untuk ikut serta dalam proses translasi. Prekursor mRNA mengalami pemprosesan yang paling ekstensif. Prekursor mRNA memiliki sebuah “cap” yang ditambahkan di ujung 5' dan sebuah “ekor” poli (A) di ujung 3'. Pada prekursor mRNA, ekson daerah yang membentuk mRNA matang dipisahkan dari intron, daerah yang tidak memiliki fungsi mengkode dan dikeluarkan oleh reaksi penyambungan. Selama reaksi penyambungan, ekson-ekson saling dihubungkan untuk menghasilkan mRNA matang. Pada eukariot, prekursor tRNA dan rRNA juga mengalalami modifikasi dan pemangkasan walaupun tidak seluas seperti mRNA.

 A. Proses Transkripsi pada Bakteri (Prokariot)

Sel bakteri hanya mempunyai satu RNA polimerase. Pengikatan RNA polmerase ke regio promotor pada DNA menyebabkan untai-untai DNA terbuka dan terpisah di dalam suatu regio yang panjang. Sewaktu polimerase melakukan transkripsi DNA, regio heliks yang belum ditranskripsi terpisah, sementara regio cetakan DNA yang telah ditranskripsi kembali bergabung dengan pasangannya. Faktor sigma dibebaskan sewaktu rantai RNA yang sedang tumbuh mencapai panjang sekitar 10 nukleotida. Reaksi pemanjangan terus berlangsung sampai RNA polimerase menjumpai sinyal terminasi (penghentian) transkripsi. Salah satu jenis terminasi terdiri dari pembentukan lengkung tajam di transkrip, mendahului sejumlah residu U. Jenis kedua mekanisme terminasi meliputi pengikatan suatu protein , faktor rho yang menyebabkan pelepasan transkrip RNA dari cetakan.

Sistron adalah regio pada DNA yang mengkode sebuah protein. Pada bakteri, mRNA biasanya dibentuk dari sebuah operon sebagai suatu transkrip polisistonik (transkrip yang mengandung informasi untuk menghasilkan sejumlah protein yang berbeda). Transkrip polisistonik ditranslasikan selagi mengalami transkripsi. Transkripsi ini tidak mengalami modifikasi atau pemangkasan dan tidak mengandung intron. Beberapa protein yang berbeda dihasilkan selama translasi transkrip polisistonik, satu untuk masing-masings sistron.

Dapat disingkat bahwa pada bakteri sebuah RNA polimerase menghasilkan prekursor mRNA, rRNA, dan tRNA. Karena bakteri tidak memiliki inti, ribosom berikatan dengan mRNA sewaktu sedang ditranskripsikan dan sintesis protein berlangsung bersamaan dengan proses transkripsi.

3.  PROSES TRANSLASI

Setelah tahap transkripsi  yaitu transkripsi DNA menjadi RNA dimana informasi diubah dari bahasa DNA menjadi bahasa RNA  (A,T,G,C menjadi A,U,G,C). Selanjutnya tahap translasi dimana penterjemahaan bahasa RNA (A,U,G,C) diubah menjadi protein (Asam amino). Informasi pada mRNA dibaca dalam kelompok dari 3 nukleotida. Kelompok 3 nukleotida itu disebut kodon. Urutan kodon pada mRNA mengatur urutan asam amino pada protein. Urutan DNA à urutan RNA = urutan kodon à urutan asam amino = protein.

RNA tersusun dari 4 macam nukleotida – A, U, G and C. Sebanyak 64 kombinasi kodon yang mungkin yang dapat terbentuk dari keempat nukleotida tersebut, tapi hanya ada 20 asam amino yang biasanya ditemukan pada protein sehingga satu asam amino dapat dikode oleh lebih dari satu kodon. Kodon dan asam amino yang dikode disebut kode genetik. Asam-asam amino dihubungkan oleh ikatan peptida. Protein biasanya mengandung ratusan asam amino (polipeptida).  mRNA dibaca dalam kelompok tiga nukleotida sehingga akan ada tiga reading frame  dimana mRNA dapat dibaca.

Translasi adalah proses penterjemahan informasi di mRNA menjadi asam amino. Mesin penterjemah di dalam sel meliputi ribosom dan RNA transfer (tRNA) tRNA  adalah penyadur yang melekat ke asam amino tertentu. tRNA mengandung urutan basa tertentu  yang disebut anti kodon, yang melekat ke mRNA melalui pasangan basa yang sesuai. Anti kodon yang dibawa oleh tRNA sesuai dengan kodon yang terdapat pada mRNA yang mengkode asam amino tertentu. Perlekatan asam amino dengan tRNA yang sesuai diatur oleh enzim amino-acyl tRNA synthetases. Tiap asam amino memiliki enzim amino-acyl tRNA synthetasenya sendiri. Asam amino dilekatkan ke ujung 3’ tRNA dengan  ikatan yang berenergi tinggi. Energi yang tersimpan pada ikatan ini akan digunakan dalam proses sintesis protein nantinya. Ikatan asam amino dengan tRNA yang sesuai dipastikan melalui mekanisme proof reading yang dilakukan oleh amino-acyl tRNA synthetase.

Ribosome merupakan protein yang dibentuk asam-asam amino melalui ikatan peptida. Ribosome adalah struktur protein-RNA yang dibuat antara ribosomal RNA and protein. Ribosome meliputi dua sub unit yang tidak sama ukurannya.Sub unit yang lebih kecil bertugas untuk memastikan bahwa kodon pada mRNA berpasangan secara tepat dengan anti kodon. Sub unit yang lebih besar berperan dalam pembentukan ikatan peptida antara dua asam amino. Kedua sub unit akan bersama hanya pada saat translasi.

Tiga tahapan pada translasi:

1.    Inisiasi : Pada tahap ini translation machinery melekat pada mRNA.

2.    Elongasi : Pada tahap ini translation machinery bergerak di sepanjang mRNA dan mensintesis polipeptida berdasarkan urutan basa pada mRNA.

3.    Terminasi : Ketika mRNA selesai dibaca dan protein telah disintesis, maka translation machinery melepaskan diri dari mRNA.

1.    Inisiasi

Untuk memastikan bahwa mRNA dibaca dengan baik, maka translasi selalui dimulai pada kodon AUG yang disebut dengan initiation codon atau start kodon. Asam amino yang melekat pada kodon ini adalah methionin (Met/M) dan tRNA yang memulai translasi disebut initiator tRNA. Initiator tRNA merupakan Met-tRNA khusus yang berbeda dari Met-tRNA lainnya. Inisiasi pada translasi difasilitasi oleh protein yang dikenal dengan initiation factors (IF).

Tahap 1:  tRNA initiator dimuat ke dalam unit kecil ribosom dengan bantuan IF (initiation factors).

Tahap 2: Tahap 2: Unit kecil ribosom melekat pada 5’ cap (Eukaryotes) /Shine Delgarno sequence (Prokaryotes) mRNA dan bergerak di sepanjang rantai mRNA sampai menemukan kodon AUG

Tahap 3:  Setelah kodon AUG pertama ditemukan, maka IF melepaskan diri dan unit besar ribosom melekat pada unit kecil ribosom.

1.      Elongasi

Ribosom bergerak di sepanjang rantai mRNA dan menghubungkan asam amino menurut                     codon yang sesuai.

            Ribosom memiliki 3 tempat khusus yaitu E, P dan A.

-          A (Amino Acyl Site): tempat dimana tRNA yang baru masuk melekat.

-          P (Peptidyl site): tempat dimana ikatan peptida yang baru dibentuk.

-          E (Exit site): tempat dimana tRNA yang telah kosong meninggalkan ribosom.

1.      Terminasi

Terminasi translasi ditandai dengan adanya kodon khusus yang disebut stop codon (UAA, UAG, UGA). Tidak ada tRNA dengan anti kodon yang dapat mengenali stop kodon. Ketika A site  ribosom menemukan stop kodon, hal ini menyebabkan perlekatan protein yang disebut release factor. Perlekatan ini menyebabkan pelepasan polipeptida dari ribosom. Setelah polipeptida melepaskan diri dari ribosom, maka ribosom memisah.

Perbedaan pada proses translasi prokariot dan eukariot dapat dilihat pada proses inisiasi.

Inisiasi Eukariot

Pada eukariot inisiasi translasi terdiri dari pembentukan kompleks yang terdiri dari metionin tRNA, mRNA, dan sebuah ribosom. Metionin tRNA (Met-tRNA) mula-mula membentuk kompleks dengan suatu faktor inisiasi (faktor inisiasi eukariotik 2 (elF2) dan GTP. Kompleks ini kemudian mengikat subunit ribosom kecil (40 S). Cap pada ujung 5' mRNA mengikat faktor inisiasi (elF4E) yang dikenal sebagai cap binding protein (CBP). Kemudian beberapa elF ikut bergabung, dan mRNA kemudian berikatan dengan kompleks 40S-Met-tRNA. Dalam suatu reaksi yang memerlukan hidrolisis ATP, subunit ribosom kecil melakukan scan terhadap mRNA sampai kodon AUG pertama ditemukan. elF lain terikat, GTP mengalami hidrolisis dan faktor inisiasi dibebaskan, dan subunit ribosom besar (60 S) terikat. Ribosom sekarang menjadi lengkap. Ribosom ini mengandung satu subunit kecil dan subunit besar. Terdapat dua tempat pengikatan untuk tRNA, yang dikenal sebagai tempat P (peptidi) dan A (aminoasil) pada ribosom. Selama inisiasi Met-tRNA berikatan dengan tempat P.

Inisiasi Prokariot

Inisiasi prokariot dan eukariot berbeda. Pada bakteri metionin-tRNA yang sedang dalam proses inisiasi mengalami formilasi menghasilkan formil-metionin-tRNA yang ikut serta dalam pembentukan kompleks inisiasi. Pada prokariot diperlukan hanya tiga IF (inisiation factor) untuk menghasilkan kompleks ini, sedangkan eukariot memerlukan selusin atau lebih eIF. Ribosom juga berbeda ukurannya. Prokariot memiliki ribosom 70S yang terdiri dari subunit 30S dan 50S, sedangkan eukariot memiliki ribosom 80S yang terdiri dari subunit 40S dan 60S. mRNA bakteri tidak memiliki cap. Identifikasi triplet AUG untuk inisiasi pada prokariot terjasi sebagai konsekuensi pengikatan sebuah urutan (yang dikenal sebagai urutan Shinr-Dalgamo) pada mRNA dengan urutan komplementer dekat ujung 3' rRNA 16S pada subunit ribosom kecil.